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    石蠟切片(FFPE)核酸提取試劑盒說明書

    簡要描述:

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    更新時間:2022-02-09

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    石蠟切片(FFPE)核酸提取試劑盒說明書

    操作流程:

    收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產物 ——> 用感受態細胞做轉化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質粒抽提——>質粒測序——>測序結果分析——>克隆信息輸入數據庫——>質粒實物保存。

    產品名稱規格貨號
    石蠟切片(FFPE)核酸提取試劑盒說明書32次/盒、96次/盒、48次/盒、50次/盒FS-01H3210



    操作流程.jpg


    PCR實驗方法步驟:

    方法

    1:在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

    10×PCR buffer

    5 μl     dNTP mix (2mM)

    4 μl     引物1(10pM)

    2 μl     引物2(10pM)

    2 μl     Taq酶 (2U/μl)

    1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)

    1 μl      加ddH2O至 50 μl

    產品特點:

    ◇高特異性:與其他病毒無交叉反應,無非特異性擴增;

    ◇高靈敏度:檢測靈敏度可達10~100拷貝;

    ◇操作簡便:該系列所有試劑均采用相同的體系和條件,可同時進行多個檢測;

    ◇高通量:多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。

    實時熒光定量PCR:

    實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:

    1)Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。

    2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

    外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現性定量方法,已得到的公認,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

    定量PCR方法:

    a、競爭法

    選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,分別測定熒光強度,根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。

    b、內參照法

    在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測

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    使用方法:

    一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。

    1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。

    2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,*用帶芯槍頭,下同)。

    3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照(濃度為 1×10E8 拷貝/μL,試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

    4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

    5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

    6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

    二、樣品 DNA 的制備

    7. 用自選方法純化樣品的 DNA,本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。

    8. 如果有 N 個樣品,則需要進行 N+2 個樣品提取,多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。

    三、設置 qPCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)

    9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6 個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于PCR 陽性對照。



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