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    介紹選擇流式抗體技巧
    點擊次數:75 發布時間:2022-08-22

         流式抗體本身也是抗體,所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件:目標蛋白特異性,反應種屬以及應用實驗。流式抗體能夠在短時間內檢測分析或分選大量細胞,在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學等領域中的應用越來越廣泛。其純度、批次穩定性、特異性,以及流式結果的可重復性備受重視。

    流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中,盡量減少實驗工序和過程,以保證實驗的真實和準確性。因此在條件允許的范圍內,建議盡量用直接標記的抗體進行實驗而不去做間接標記。

          隨著流式細胞術的日益發展,流式抗體及熒光標記產品的種類、數量也在不斷增多,加上多色分析實驗方案需求的增長,逐漸產生了抗體難選擇、熒光難搭配等問題,如何選擇合適的流式抗體,也成為了流式技術是否能成功的關鍵因素之一。下面介紹選擇流式抗體技巧:

    一、滿足抗體具備的基本條件

    確定所需檢測的指標,目的細胞的特異性表面標記或胞內標記;

    根據檢測樣本的種屬選擇抗體,流式抗體基本無法進行種屬交叉反應;

    根據抗體的說明,明確是否可以用于流式實驗。

    二、確定所使用儀器的參數配置

    激光器:不同的流式細胞儀激光器不同,常見的有405nm,488nm和635nm,需要根據具體的儀器進行確定。

    濾光片:檢測通道的多少,決定最多可以同時檢測幾個指標。熒光素的發射波長與濾光片有關,所選擇熒光素要在儀器的可檢測范圍內。

    儀器:相同的熒光在不同的儀器上檢測通道可能不同,需要參照儀器的說明。

    三、熒光的選擇

    熒光有強弱之分,如抗原表達弱或分群不明顯的建議選擇強熒光,如PE、APC;反之,抗原表達強或分群明顯的建議選擇常用的弱熒光例如FITC即可。常用熒光強弱排序程度為:PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC

    四、多色熒光搭配

    很多實驗需要同時檢測幾個指標,此時就需要多個熒光標記進行搭配。流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定的:流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標、廠家的抗體有多少種熒光標記。

    能檢測多少通道是又激光決定的需要注意所使用的儀器有哪些激光。每個檢測通道只能選擇1種熒光素,各通道之間的熒光素可以隨意搭配,檢測通道不能沖突。

    如果需要做多個指標,而流式細胞儀能檢測的通道不夠,首先將指標歸成2類,再將樣本分成2份,分別進行檢測。

    所選各種熒光素光譜的重疊應當盡量減少,否則將會導致較大的補償。例如,PE-Ccy5與APC同時標記,將會導致補償過度,需換成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。
    五、同型對照抗體

    同型對照,是用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色,類似于陰性對照,是流式細胞實驗*的一項。

    同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型及亞鏈、相同熒光標記的免疫球蛋白,也要求使用相同劑量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1),同型對照則為Mouse IgG1-FITC.

    如果是純化的一抗加熒光標記的二抗,那么應該選擇與一抗相對應的同型對照抗體,如純化的CD3+PE標記的二抗,則對照為純化的同型對照+ PE標記的二抗。

    有時候同型對照的表達會比抗體的表達高,首先檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次,因為有些標志在細胞的表面或者胞內表達不高,而跟其類似的抗原非常多,那么同型對照非特異性的結合會超過抗體的特異性,所以會造成這種現象。這個時候推薦使用其他陰性對照,如空白對照等。



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