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    解析逆轉錄實驗中操作問題
    點擊次數:112 發布時間:2022-08-01

     

           逆轉錄(reverse transcription)實驗作為是常見的分子生物學實驗之一,逆轉錄是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程,即 RNA 指導下的 DNA 合成,逆轉錄實驗包括3大要素,分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板。雖然看上去步驟簡單,但是逆轉錄實驗中實際操作時常出現問題如下:

    1. 如何提高 RT-PCR 反應的靈敏度與特異性?

    ① 確定模板 RNA 完整性好,無 DNA 污染。

    RNA 模板中不應含有擴增反應抑制劑。

    ③ 使用適量的模板 RNA ,模板量太多會降低特異性,太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱。

    ④ 若模板中有二級結構,可通過提高逆轉錄反應溫度來提高擴增效果。

     

    2.  RNA 中含有逆轉錄抑制劑時,怎么處理?

    逆轉錄抑制劑包括:SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等??蓪⒁汛_定的高質量 RNA 模板同樣品混合,同高質量 RNA 模板比較產量以檢測 RNA 抑制劑;若高質量模板 RNA 與樣品混合后產量降低,則說明樣品中存在逆轉錄抑制劑,可用70%v/v)乙醇對 RNA 沉淀進行清洗,以除去抑制劑。

     

    3. 逆轉錄后的 qPCR 實驗 Ct 值偏大或者普通 PCR 產量低。

    RNA 模板質量差,需要重新制備 RNA 模板,可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。

    ② 逆轉錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉錄試劑成分,可能會對后續的PCR 產生抑制作用,所以可以適當梯度提高 cDNA 稀釋比例(通常來說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍,其*佳模板加入量以擴增得到的 Ct 值在20-30個循環為好)。

    ③ 起始的 RNA 模板量低,需要減少稀釋倍數或增加 RNA 模板量。

    ④ 基因本身原因(復雜和長度),可以重新設計復雜基因的引物,避免復雜結構?;蛘哂萌椒ǔ绦蚧蜓娱L兩步法程序的延伸時間。

    ⑤ 逆轉錄或者定量產品性能差,可以通過做平行不用品牌產品對比實驗,對比逆轉錄產品性能。

     

    4. 逆轉錄酶擴增效率評估,應該關注哪些指標?

    建議: qPCR-ct 值,或者 PCR 產量

    如果想比較逆轉錄性能,尤為直接的還是后續做 qPCR 或者 PCR 平行對比實驗,這種方法相對較為準確。

    不建議:cDNA 中間產物濃度測定 or 其他方法。

    逆轉錄完成后是不建議測定產物濃度的,由于逆轉錄后產生 RNA-cDNA 雜交鏈,溶液中的 RNA 和部分 DNA 會對吸光值產生影響,所以測定出來的產物濃度并不準確,即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進行對比實驗,由于不同品牌之間的逆轉錄體系具有或多或少的差異,其體系中的各種離子等都能對吸光度產生影響,所以測定的結果也沒有可比性。

     

    優化及注意事項:

    1、 逆轉錄 PCR 時,提取 RNA 是關鍵,需分離高質量 RNA(純度和完整性)。

    2、 整個操作過程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材。

    3、 逆轉錄過程中要謹防 RNA 酶的污染,加入 RNA 酶抑制劑。

    4、 為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照。

    5、 逆轉錄實驗應全程在冰上操作完成,操作過程應避免 RNase 污染。

    6、 提高逆轉錄預熱溫度(也可根據相應逆轉錄試劑盒進行調整)。

    7 減少基因組 DNA 污染,可使用去基因組的逆轉錄試劑盒。

     

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