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    簡述白色念珠菌PCR試劑盒反應的要素
    點擊次數:73 發布時間:2022-07-26
      白色念珠菌PCR試劑盒因其操作簡單,靈敏度高,特異性好,經濟安全等特點而在臨床上廣泛應用,但是由于其操作步驟復雜,一般包括試劑準備,樣本收集,加樣,溫育,洗滌,顯色,比色,結果判定等,其中任何一項操作不當都會對檢測結果產生很大影響。
     
      今天咱們來了解下白色念珠菌PCR試劑盒反應的要素:
     
      引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:
     
      1、引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。
     
      2、引物擴增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
     
      3、引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC*隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
     
      4、避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
     
      5、引物3'端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
     
      6、引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處。
     
      7、引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
     
      8、引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
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