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    詳解PCR反應條件的選擇
    點擊次數:160 發布時間:2022-07-18

    PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

    溫度與時間的設置:基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA9095℃變性,再迅速冷卻至40 60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至7075℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

    1、變性溫度與時間:

    變性溫度低,解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃~94min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性,就會導致PCR失敗。

    2、退火(復性)溫度與時間:

    退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:

    Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)

    復性溫度=Tm-(510℃)

    Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合, 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為3060sec,足以使引物與模板之間完全結合。

    3、延伸溫度與時間:Taq DNA聚合酶的生物學活性:

    7080150核苷酸/S/酶分子

    7060核苷酸/S/酶分子

    5524核苷酸/S/酶分子

    高于90℃時, DNA合成幾乎不能進行。

    PCR反應的延伸溫度一般選擇在7075℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間,可根據待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些。

     

     

     


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