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    論述PCR反應條件的控制
    點擊次數:143 發布時間:2022-06-28
            PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。
      溫度與時間的設置:基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40 ~60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。PCR反應條件的控制如下:
    1.  PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
    2.  鎂離子濃度總量應比dNTPs的濃度高,常用1.5 mmol/L。
    3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,20~200 umol/L。
    4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。 
    5.  引物 濃度一般為0.1 ~0.5 umol/L。 
    6.  反應溫度
    (1)變性溫度和時間95℃,30 s。
    (2)退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。
    (3)延伸溫度和時間72℃,1 min/kb(10 kb內)。
    (4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)。

    7.  循環次數 

    一般為25 ~30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低,可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數并不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右,循環數超過30個以后,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產物的量不再隨循環數的增加而增加,出現了所謂的“平臺期"。


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