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    解決PCR產物中出現假陰性或無擴增產物
    點擊次數:276 發布時間:2022-05-23

    解決PCR產物中出現假陰性或無擴增產物(即陽性對照中有條帶,而樣品則無條帶)方法:

      1、條帶放置時間過久,核酸被降解,最好在48h內進行電泳檢測。

      2、DNA模板純度低,如含有雜蛋白質或Taq酶抑制劑,可對DNA進行再次純化或重新用優質試劑盒提取DNA; DNA濃度太低時,可以加大模板量;對具有二級結構DNA使用較好的聚合酶;提取DNA時,避免吸入酚類試劑。

      3、對設計不合理的引物進行重新設計合成;引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融而降解失效;檢測引物OD值并進行電泳檢測以確保兩條引物濃度一致。

      4、酶失活時,更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。

      5、PCR反應條件:提高變性/退火溫度;適當增加循環次數。

      6、Mg2+濃度過低可影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗,而Mg2+濃度過高會降低PCR的特異性,因而可適當提高Mg2+濃度。

      7、如果靶序列發生突變或缺失時,也會影響引物和模板的特異性結合,產生假陰性結果。

      Q3:非特異性條帶擴增或者條帶出現拖尾現象

      Answer:

      1、當引物特異性差或引物形成二聚體時,可重新設計引物或者使用巣式PCR

      2、若模板或引物濃度過高,可適當降低模板或引物濃度

      3、酶量過多,則適當減少酶量

      4、Mg2+濃度偏高,則降低鎂離子濃度

      5、退火溫度偏低,適當提高退火溫度或使用二階段溫度法(94變性,65左右退火與延伸)

      6、循環次數過多,不僅會降低擴增效率,且會使錯誤摻入率增加,因此需要減少循環次數。


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