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    原代細胞培養實驗步驟
    點擊次數:380 發布時間:2022-04-24

    原代細胞培養實驗步驟:

    1、取7-10d雄性SD大鼠,頸椎脫臼處死,浸泡于75%乙醇消毒3-5min。

    2、在超凈工作臺中,將大鼠斷頭置于玻璃培養皿中,打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中,去除小腦和間腦。

    3、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。

    4、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜,保留大腦皮質。

    5、大腦皮質放于DMEM中(含慶大霉素和谷氨酰胺 ),剪碎成約1mm3大小,放入50ml的離心管中,加入混合酶液I(0.05-0 .1%II型膠原酶,0 .025-0 .05%IV型膠原酶,200-400U DNaseI),混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

    6、室溫1 000×g離心8min,去上清液。

    7、沉淀中加入20%BSA重懸浮,充分混勻,1 000×g,20min,4℃離心,去上清。

    8、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1%的膠原酶/分散酶,0.05-0.1%I型膠原酶,100-300U DNaseI )重懸浮,混勻,37℃水浴消化0.5-1h,700×g室溫離心6min,去上清液。

    9、沉淀加入2ml DMEM(含慶大霉素和谷氨酰胺)培養液懸浮混勻,鋪于經離心形成連續梯度的12ml 50%Percoll(25 000×g,60min,4℃),1000×g,4℃離心10min。

    10、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,吸出后DMEM
    漂洗兩次(離心1000×rpm,6min,室溫),去上清液。

    加入DMEM完全培養液(20%FBS,4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮,接種于含5%的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中,置于37℃、5%CO2培養箱內靜置培養24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養基,隨后隔天換液。


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