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    活性蛋白試劑盒提取操作步驟
    點擊次數:227 發布時間:2022-04-19

    本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養細胞中提取具有活性的全蛋白, 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液

    Lysis Buffer 勻漿裂解組織或細胞,作用溫和,提取過程簡便。獲得的全蛋白可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶 的活性的測定的等后續研究,但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究,因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑。 應用方面:可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶活性測定等后續研究。

    操作步驟

    Ⅰ、實體組織蛋白的提取

    1、在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制劑,1 μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF,混勻。冰上保存數分鐘待 用;

    2、 每 100mg 固體組織置于培養皿中,手術剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊,加入 0.5~1 mL 冷 Lysis Buffer,玻 璃勻漿器上下手動勻漿 15 次,注意低溫操作;

    3、取組織勻漿液轉移到 1.5mL 預冷的離心管,離心 10000 轉/分,4℃離心 5 min;

    4、取上清轉移至新的預冷的離心管中,即為全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);

    5、分裝保存于-70℃,避免反復凍融。


    Ⅱ、培養細胞蛋白提取

    1、 貼壁培養的細胞,吸去培養基后,加入 10mL/150mm 培養板的冷 PBS 洗兩次,每次振搖數次以盡量去除培養液;

    2、  懸浮培養的細胞或用細胞刮子刮下的貼壁細胞,將細胞及培養液移至離心管中,1000 轉/分離心 10 min,再用10mL/150mm 培養板的冷 PBS,1000 轉/分離心 5 min 洗兩次;

    3、 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制劑,1μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF(用戶自配:濃度 100mM, 溶于異丙醇),混勻。冰上保存數分鐘待用;

    4、 在上述培養板或離心管的細胞中,加入上述配制好的冷 Lysis Buffer;

    5、冷室或冰上操作,貼壁細胞用細胞刮子刮下,皆 Lysis Buffer 一同轉移至新的預冷的離心管中;懸浮培養或裂解前刮下的貼壁細胞皆 Lysis Buffer 一同轉移至新的預冷的離心管中;

    6、置于 4℃搖床平臺上,溫和振蕩 15 min;

    7、14,000rpm,4℃離心 15min,取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);

    8、  分裝保存于-70℃,避免反復凍融。

    注意事項:

    所有接觸樣品的用具及試劑均需預冷。我們在提取蛋白后,如有必要,可透析除去表面活性劑。


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